里氏木霉（T.reesei）

里氏木霉（T.reesei）

T.reesei，一种无性繁殖的丝状真菌，是重要的降解纤维素材料的丝状真菌的一种，可分泌一整套降解纤维素的酶系。其中以外切葡聚糖、纤维二糖水解酶的产量最高，占胞外分泌蛋白总量的60%以上。T.reesei长期被用于生产纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶等多种酶类（王肖燕，2012）。T.reesei具有典型的真核蛋白修饰特性和理想的蛋白分泌能力，已被作为基因工程宿主菌用于生产外源蛋白，并且为生产药用人源蛋白进行遗传改造，例如N-糖基化路径的人源化改造。龙昊等的T.reesei全基因组测序工作已经完成，对深入了解该工业菌株具有重大意义，同时为鉴定与该菌生长代谢相关的关键基因提供了良好平台。

Chritian等（2013）分析了一株T.reesei Rut-C30突变菌株，其具有非常高水平的木聚糖酶表达量（即使在无诱导物添加的情况下）。研究揭示这株菌由于编码木聚糖酶的Xyr1基因单位点突变，导致内生木聚糖酶一反常态地表达量升高，并且伴随着纤维素酶表达量的提升。这个突变位点通常位于双核锌簇转录因子区域。但只在槐糖诱导下纤维素酶含量才有些微小的提升。在所有分析条件下，cbh1和cbh2的转录水平形成受到xyr1转录水平的严格限制。与野生型QM6a不同的是，在突变体菌株中xyr1与cbh1/cbh2在转录水平和槐糖可诱导性方面并无严格相关性，但在野生型菌株中确实严格相关。

Kautto等（2013）结合生物化学、转录组学和激光共聚焦方法，分析了T.reesei中纤维二糖分解酶Ⅰ（CBHI）突变造成的细胞水平效应。将突变的CBHI进行荧光标记，构建融合蛋白的亚细胞定位系统及与蛋白酶组关联。突变的CBHI造成了Rut-C30的某些生理改变，例如菌丝，并影响了酶的分泌。一批与 UPR-和ERAD-相关基因 sec61，der1，uba1，bip1，pdi1，prp1，cx1和lhs1得到正调控。进一步借助MG132（N-benzoylcarbonyl（Cbz）-Leu-Leu-leucinal）抑制蛋白酶的功能。MG132 对蛋白酶编码基因具有特殊的作用，这项研究首次报道了丝核菌中蛋白酶对蛋白品质的调控作用。激光共聚焦分析认为，突变CBHI在ER中累积，并与蛋白酶共处。这项研究揭示了在一定的分泌压力下，T.reesei Rut-C30高产蛋白是有一定限度的。

利用分子标签技术获得突变体已成为进行基因克隆和遗传分析最有效的方法之一。建立T.reesei基因标签的插入突变体库是该领域功能基因组学发展的趋势（钟耀华等，2007）。Zhang等（2011）建立了高效的T-DNA插入突变筛选系统。他们认为农杆菌介导的T-DNA转化作为建立插入突变和研究基因功能行之有效的手段，需要同样高效的转化及筛选步骤。研究者利用绿色荧光蛋白（GFP）作为重要标记，建立了T.reesei高效T-DNA插入突变和筛选系统。一株尿苷营养缺陷型菌株M23被转进农杆菌EH105携带的整合了pyrG基因（用于在不添加尿苷的基本培养基中初筛）和egfp基因（用于对遗传稳定菌株进行荧光筛选）的双向质粒pCOEP，转化效能可达10～20转化子每105个目标分生孢子。通过荧光显微镜可在分生孢子、生长菌丝和菌丝中检测到GFP荧光蛋白强烈的信号。研究建立了T.reesei中通过96孔板和多标号计数记录荧光强度的快速高效筛选 T-DNA标签突变体的方法。进一步，通过Southern杂交分析确定了基因组中T-DNA的插入状态。该研究利用GFP作为重要标记，建立了T.reesei中快速鉴定染色体水平上T-DNA插入突变和功能基因分析的方法体系。

木霉研究中，菌株高效筛选标记的数目有限，难以实现对菌株的多基因连续敲除。因此，建立丝状真菌选择标记删除系统有利于对丝状真菌进行多次遗传改造。尿嘧啶营养缺陷型标记具有转化效率高、容易得到转化子等优点，研究中通常将尿嘧啶营养缺陷型的互补基因pyrG转入相应的营养缺陷型菌株，使pyrG基因与受体菌的缺陷基因互补，使受体菌表现野生型生长而作为选择标记。构建基因敲除载体时，在标记基因联测时分别添加一段短的正向重复序列，这样转化，用来切除转化子中的pyrG基因，再在添加5-氟乳清酸（5-FOA）的培养基上筛选即可得到不带有标记基因的目的基因敲除菌株。该策略在多基因连续敲除中，可实现选择标记的重复使用而不引入其他标记基因（王肖燕等，2012）。

基因工程研究中，影响外源蛋白产量的因素有启动子强度、启动子拷贝数、信号肽和蛋白质稳定性等。内源基因的高效表达可能会影响外源蛋白的产量。王肖燕等（2012）认为，T.reesei表达外源蛋白时，cbh1，cbh2，eg1，eg2等主要内源基因在机体内相对高效的表达势必会影响外源基因的表达，他们以此为背景构建了T.reesei主要内源纤维素酶基因缺失菌株，目的在于提高外源蛋白的表达量。他们利用重组PCR技术分别构建了以尿嘧啶营养缺陷（pyrG）为选择标记的cbh1和cbh2敲除盒，并添加了一个短的正向重复序列，以保证筛选标记基因的重复利用。两基因敲除盒分别转化T.reesei Δtku70菌株，基本培养基上筛选得到基因单敲除菌株Δcbh1：：pyrG⁺和Δcbh2：：pyrG⁺。继而用5-氟乳清酸对Δcbh1：：pyrG⁺反筛，得到不带标记基因的cbh1基因敲除菌株Δcbh1。并在敲除cbh1的基础上进一步敲除cbh2，构建两基因双敲除菌株Δcbh1Δcbh2：：pyrG⁺，经过5-氟乳清酸反筛去除标记基因得到双敲除菌株 Δcbh1Δcbh2。接着对 T.reesei 转化子进行了 PCR，Southern验证和PAGE 分析，实验结果表明基因缺失菌株构建成功，其中 Δcbh1和Δcbh1Δcbh2菌株已不含有原先转入的筛选标记基因。菌株培养物上清液PAGE电泳分析：cbh1缺失菌株Δcbh1外切葡聚糖酶I的量与出发菌株相比明显下降，而外切葡聚糖酶II的分泌量有所提高；cbh2缺失菌株Δcbh2：：pyrG⁺外切葡聚糖酶Ⅰ的量与出发菌株相比没有太大的变化，外切葡聚糖酶Ⅱ的分泌量有所下降；cbhl/lcbh2双缺失菌株Δcbh1Δcbh2外葡聚糖酶I和外切葡聚糖酶II的量与出发菌株相比均明显下降。该研究对T.reesei Δtku70菌株进行目的性的分子生物学遗传改造，成功构建了cbh1和cbh2 基因单敲除及双敲除菌株。研究中在标记基因两侧各添加一段短的重复序列使标记基因重复利用的策略为多基因的连续敲除提供了一条行之有效的途径。

龙昊（2006）建立了pyrG基因选择标记建立的T.reesei转化体系。他们利用紫外线诱变技术获得了一株T.reesei pyrG基因缺陷菌株M23。该菌株在不含尿嘧啶核苷酸的培养基上无法生长，而转化含有pyrG基因的质粒pAB4-1后可正常生长。转化率为每微克质粒200～300个转化子，该研究构建的pyrG基因缺陷型菌株的获得为构建T.reesei的新遗传转化系统奠定了基础。

钟耀华等（2007）利用农杆菌AGL1介导成功转化了T.reesei QM9414。研究将T-DNA随机插入T.reesei染色体中，获得一批T.reesei T-DNA插入突变体，并得到具有潮霉素抗性的转化子，转化效率和稳定性高。序列分析证明T-DNA为随机插入T.reesei染色体中的。研究共获得经分子验证的突变菌株200余株，建立了插入突变体库。他们进一步对突变体子库进行表型筛选，发现了7株形态异常的突变子，有其中两个突变子的T-DNA插入位点恰好位于同一个基因的不同位点，通过序列对比和系统分析，该基因编码类胡萝卜素双加氧裂解酶（CCD），被命名为TrCCD1基因。两个突变子的T-DNA插入位点分别位于TrCCD1的开放阅读框和启动子区（Promoter），分别被命名为ccdO和ccdP。两突变体比出发菌株在MM平板上生长减速近一半，菌落也相对疏松；在含0.2%TritonX-100的MM平板上生长始，突变子菌落形成长的气生菌丝，导致菌落蓬松；突变子的菌丝顶端与菌丝中间区域相比明显有变化，即菌丝顶端颜色变暗；突变子在PDA平板培养4d后，仅有中间部位产生绿色孢子，周边围绕白色菌丝，而出发菌株产孢面积明显较大。他们利用丙酮对分泌到培养基的类胡萝卜素进行吸光度检测和β-胡萝卜素高效液相色谱（HPLC）测定。突变菌株分泌到PDA培养基中的β-胡萝卜素比出发菌株降低近一半。说明TrCCD1基因的突变与类胡萝卜素的含量直接相关，而且在类胡萝卜素的代谢中具有重要作用。他们推测，突变影响了某种具有重要信号作用的类胡萝卜素分子的生成，从而导致了T.reesei菌丝生长和孢子发育的异常，也同时说明TrCCD1基因在生长发育过程中扮演了重要的调控作用。另外5株突变子（PM2，PM48，HP7，HP13和HPL1）也形态各异，与出发菌株有明显区别，菌丝延伸较慢，有的菌落呈明显辐射状，有的菌落布满白色菌丝，无产孢迹象。其中PM2的菌丝顶端弯曲缠绕，形成了卷曲成团的头部。通过TAIL-PCR扩增分析，PM48的插入位点在一个编码细胞周期相关蛋白的基因编码区，HPL1的插入位点编码的蛋白可能是一个多聚腺苷酸结合蛋白，该基因突变引起了纤维素降解能力的变化。为了获得纤维素降解突变菌株，钟耀华等（2007）利用CF11平板透明圈筛选法，筛选到4株纤维素降解突变子：PM3，PM23，HPL1和36H-6。其中，PM3和PM23的透明圈增大，HPL1和36H-6的透明圈减小。纤维素酶活力测定发现，各菌株的FPA活力在18～24h之间达到高峰值，其中PM3和PM23的FPA最高活力比出发菌株高30%以上，PM3也是最先达到酶活最大值的菌株，而PM23的FPA活力持续时间最长。突变子HPL1和36H-6的FPA活力始终低于出发菌株，HPL1的FPA活力一直处于较低水平，最高酶活力仅为出发菌株的三分之一；36H-6的酶活力随时间延长下降很快，48h就几乎丧失活力。各突变体菌株的CMCase都是在24h达到酶活高峰，PM3和PM23的最大酶活力比出发菌株高，而HPL1和36H-6比出发菌株低。值得注意的是，HPL1的FPA和CMCase活力始终处于较低水平。他们同样利用TAIL-PCR分析了HPL1菌株T-DNA右侧翼序列，发现该突变基因编码的蛋白可能是多聚腺苷酸结合蛋白，突变位点位于基因上游26bp处，基因功能与RNA加工和修饰有关。

傅科鹤（2013）针对在玉米生产过程中拮抗T.reesei受到重金属等理化逆境因子，而影响其生物防治效果的现象，期望通过突变体菌株创造耐受或吸附重金属的生防菌剂，将对研究木霉菌剂与含重金属的化学农药混用具有实际意义。研究采用了ATMT突变体系统构建方法，构建了1800余株突变体的突变体库，其中一株高吸附突变体A01的铜吸附特性较为突出。当培养基内铜离子初始浓度为0.7mM，初始pH值为5.0时，AT01的铜吸附率达到了96.1%，几乎二倍于野生菌的铜吸附特性；同时，由于铜吸附作用，AT01的菌体颜色呈现明显的铜绿色，表明细胞吸附了大量的铜离子。进一步的透射电镜观察表明，铜进入细胞内后，主要累积在液泡中。通过Southern印记分析，该突变体为T-DNA单拷贝插入，并且其右边界全部缺失而左边界完整（通过反向PCR扩增插入位点侧翼序列）。进一步对插入点基因情况进行分析，发现T-DNA插入在一个基因家族的两个功能基因之间，未对功能基因进行直接破坏。通过生物信息学分析3个与铜吸附相关基因，分别为TM，Ctr2，Ctr3，其中TM编码转录因子，调控胞外低浓度铜胁迫下跨膜通道蛋白（与铜吸附相关）表达，从而促进细胞对铜吸附作用，维持胞内同正常浓度。当ATMT介导基因被敲除后，在含0.2m MBCS（铜螯合剂）的TPDA培养基中培养时生长受到明显限制，菌落直径仅为野生菌的18%，说明该基因对细胞铜吸收功能有重要作用，而且基因互补发现功能得到恢复。随后的荧光定位实验显示，培养基添加BCS后，TM编码蛋白具有表达信号，初期在核内表达，后期转移到胞壁与某些通道蛋白结合。另外两基因Ctr2，Ctr3为铜吸附相关功能基因，被敲除后，Ctr2铜吸附能力比野生型降低20%，Ctr3无明显变化。Ctr3y荧光定位互补结果表明，编码蛋白主要在细胞壁。

物理诱变主要是紫外诱变方法被应用在T.reesei突变体系的构建中。乐易林等（2004）对T.reesei Rut C-30通过紫外照射进行诱变，选育出了一株高产木聚糖酶活力的菌株，其酶活比出发菌株提高。并通过正交试验证明了培养时间对产酶的影响最大，其次是磷酸钾和七水硫酸镁，培养温度对酶活影响最小。覃玲灵等（2011）利用T.reesei产纤维素酶的特性，通过紫外辐射诱变筛选出高产纤维素酶的突变菌株，进一步提高纤维素酶的产量，降低生产成本。研究者对T.reesei Rut C-30的孢子悬液进行紫外线诱变（处理40min，致死率83.5%，正突变率8.679%），刚果红筛选培养基初筛、液体发酵产酶复筛后，获得一株突变体A13，其滤纸酶活为4.328U/mL，比出发菌株提高了55.3%。六世代连续培养后，酶活力可以稳定在4.160U/mL，且遗传稳定性好。正交试验得到突变体A13产酶的最佳条件：1.00%微晶纤维素（碳源）、0.15%蛋白胨+0.05%硫酸铵（复合氮源），产酶温度28℃，优化后，A13的纤维素滤纸酶活比优化前提高了18.15%。另外，在微晶纤维素的产酶培养基中添加适量麦芽浸粉可促进产纤维素酶（添加1%麦芽浸粉）。随后对4株突变菌株及出发菌株进行RAPD分析，对RAPD-PCR反应体系进行优化筛选6个随机引物，对扩增条带进行聚类分析，结果显示突变菌株和出发菌株间具有较近的亲缘关系，但存在一定的遗传变异。